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探討不同來源的細胞因子誘導的殺傷細胞體外抗腫瘤作用的比較研究

作者:2017-06-03 18:16文章來源:未知
  細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killercells,CIK)是一群異質性的具有抗腫瘤作用的細胞。CIK 細胞主要表達CD3 和CD56, 抗腫瘤活性強,增殖迅速。用患者自身PBMC 誘導的CIK 細胞已經顯示良好的臨床療效,尤其對慢性髓系白血病、肝癌、結直腸癌、腎癌、肺癌、乳腺癌等。但是腫瘤患者在經歷了放化療后,經常出現白細胞減少、貧血等癥狀。尤其晚期惡性腫瘤患者每毫升外周血中單核細胞的數量也較正常人少。因此為了減輕患者負擔,提高臨床療效,本研究比較了來自健康捐助者的臍血CIK 細胞和來自肺癌患者外周血的CIK 細胞在體外的抗腫瘤作用,并初步探討了其機制上的差異,以尋找更有效可行的CIK治療方法。
  1 材料與方法
  1.1 材料來源
  白血病細胞系K562 和肺癌細胞系A549 由吉林省腫瘤防治研究所常規傳代培養。Recombinant human interleukin (IL) -2、IFN-γ、CD3 -mAb (OKT -3)、IL-1α 購自Biolegend。PI、anti-CD3-ECD、anti-CD56-PC5、anti -CD8 -PC5、anti CD3 -FITC、anti -CD8 -FITC及相應的同型對照抗體均購自貝克曼庫爾特公司。5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester(CFSE)購自Molecular Probes。Annexin V apoptosis kit 購自BD公司。MonensinSolution(BioLegend,Cat.420701)。PEanti-human CD107a (Lysosome-Associated MembraneProtein 1,LAMP-1,BioLegend,Cat. 328608,Clone: H4A3)。CCK-8 購自碧云天生物技術公司。
  1.2 方法
  1.2.1 誘導培養CIK 細胞肺癌患者外周血(4 份,
  10 mL/份)來自吉林省腫瘤醫院住院患者(2014 年8 月~2015 年8 月);4 份臍血(10 mL/份)來自吉林省婦幼保健院(2014 年8 月~2015 年8 月)。血液樣本分別經紅細胞裂解液處理后, 獲得的細胞被培養在IMDM 培養基中(10% FCS,37℃,5%CO2飽和濕度),細胞濃度(1~2)×106/mL。培養24 h 后,加入1000 U/mLIFN-γ,CD3-mAb (50 ng/mL),IL-2(300 U/mL),IL-1α(100 U/mL),繼續培養并每3 天半量換液或擴瓶1 次,同時補加IL-2(300 U/mL)。在培養的第14 天和第21 天收獲細胞,流式細胞儀檢測分析(BeckmanCoulter Epics XL-MCL) 細胞表型, 即CD3+CD56 + 、CD3+CD8+ 細胞百分率。
  1.2.2 CIK 細胞增殖實驗采用CCK-8 染色法檢測誘導培養21 d 的臍血CIK 細胞和來自肺癌患者外周血的CIK 細胞的增殖率。調整CIK 細胞的初始密度為5×104/mL,37℃、5% CO2培養箱中培養,每3 天擴瓶1 次,CCK-8 染色, 酶標儀檢測(490 nm), 直到第21 天,計算增殖率并分析比較實驗結果。
  1.2.3 CIK 細胞體外抗腫瘤活性實驗(流式細胞儀法)
  標記靶細胞:A549 和K562 細胞用PBS 洗1 遍,調整細胞濃度為1.5×106/mL,CFSE(2.5 μmol/L) 標記細胞,37℃孵育8 min,PBS 洗細胞1 次,加入1 mL IMDM(含10% FCS),室溫避光孵育10 min,再加入PBS 洗細胞1 次備用。標記效應細胞:調整CIK 細胞濃度為1×106/100 μL,標記用CD3、CD8 和CD56 抗體,室溫避光孵育30 min,細胞用PBS 洗1 次備用。調整靶細胞密度為5×104/mL,設置不同的效靶比,分別為1∶1、5∶1、10∶1,相應的CIK 效應細胞濃度分別為5×104/mL、25×104/mL、50×104/mL,分別設單獨的靶細胞和效應細胞對照,37℃、5% CO2培養箱中培養24 h 后,PI 染色,流式細胞儀檢測分析。
  1.2.4 CIK 細胞體外抗腫瘤活性實驗(MTT 法) 按上述同樣的效靶比將細胞接種于96 孔板中, 靶細胞濃度為2×104/孔,37℃ 5% CO2培養箱中培養24 h 后,加入CIK 細胞,MTT 法檢測CIK 對靶細胞的殺傷效率。酶標儀檢測490 nm 處吸光度(A)值。抑制率(%)=[1-(實驗組A 值-CIK 細胞A 值)/腫瘤細胞A 值]×100%。
  1.3 觀察指標
  1.3.1 檢測CIK 細胞CD107a 表達調整CIK 細胞濃
  度為1×106/100 μL,加入CD107a-PE(10 μL),37℃,5% CO2培養箱中培養1 h 后,加入Monensin,將效應細胞和靶細胞按10∶1 的效靶比混合,37℃,5% CO2培養箱中培養3~4 h,PBS 洗細胞1 次,標記細胞用相應的CD3、CD8 和CD56 抗體,2%多聚甲醛固定細胞,流式細胞儀檢測分析。實驗設陰性對照(單獨CIK 組)以控制自發產生的CD107a。
  1.3.2 細胞因子的檢測按前述方法將10∶1 混合的效靶細胞(A549) 培養24 h 后,ELISA 法檢測培養上清中IFN-γ 和TNF-α 表達。
  1.3.3 細胞凋亡實驗按前述方法將10∶1 混合的效靶細胞(K562)培養24 h 后,收集細胞,Annexin V/PI 染色,流式細胞儀檢測分析,每個樣本收集10000 個細胞。數據分析采用Coulter EXPO 32 v1.2 軟件。
  1.4 統計學分析
  數據分析采用SPSS 17.0 統計學軟件,計量資料以(x±s)表示,組間比較采用方差分析、t 檢驗及配對t檢驗,P<0.05 為差異具有統計學意義。
  2 結果
  2.1 流式細胞術檢測誘導培養的CIK 細胞表型來自肺癌患者外周血和臍血的CIK 細胞在誘導培養的第14 天和第21 天的細胞表型檢測結果表明,隨著培養的延長,CD3+細胞、CD3+CD56+和CD3+CD8+細胞百分比升高。培養第14 天時,來自肺癌患者外周血CIK 細胞的CD3+細胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞百分比分別為(86.00±5.25)%、(66.88±2.56)%、(14.90±5.79)%;臍血CIK 細胞的CD3+細胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞百分比分別為(90.68±1.77)%、(69.00±7.60)%、(20.13±3.09)%。培養第21 天時,來自肺癌患者外周血CIK 細胞的CD3+細胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞百分比分別為(91.13±5.48)%、(70.58±2.49)%、(14.98±5.53)%;臍血CIK 細胞的CD3+細胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞百分比分別為(96.83±1.18)%、(76.15±5.78)%、(21.35±2.70)%。雖然臍血CIK 細胞的CD3+、CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞百分比高于肺癌患者外周血來源的CIK 細胞,但二者之間差異無統計學意義(CD3+細胞百分比:P=0.1348;CD3+CD8+細胞百分比:P=0.0836);CD3+CD56+細胞百分比:P=0.1269。
  2.2 CIK 細胞增殖實驗結果
  本研究使用CCK-8 染色實驗檢測CIK 細胞的增殖能力,培養21 d 的肺癌患者外周血和臍血來源的CIK 細胞增殖率分別為(185.76±39.68)%、(254.32±74.60)%,二者之間差異有統計學意義(P=0.0012)。
  2.3 CIK 細胞體外抗腫瘤活性實驗(流式細胞儀法)結果
  CIK 細胞與腫瘤細胞共孵育后,CIK 細胞表面CD3、CD8、CD56 的表達率與單獨CIK 對照組相比沒有發生明顯變化。以死亡的靶細胞標記為CFSE+PI+為依據,進一步比較來自肺癌患者和臍血的CIK 細胞的抗腫瘤活性,結果表明,二者對A549 和K562 細胞均有抑制作用,來自臍血的CIK 細胞有更強的抗腫瘤作用。
  2.4 CIK 細胞體外抗腫瘤活性實驗(MTT 法)結果根據公式計算來自肺癌患者外周血和臍血的CIK 細胞對A549 和K562 細胞的體外生長抑制率,結果顯示腫瘤患者自體CIK 細胞和臍血CIK 細胞均有不同程度的抗腫瘤效應且隨效靶比的升高而增加;效靶比相同時,臍血CIK 細胞的體外抑瘤活性高于來自肺癌患者的CIK 細胞。2.5 檢測CIK 細胞CD107a 表達實驗結果本研究通過檢測CD107a 的表達來間接說明CIK細胞的細胞毒性功能,實驗結果表明,臍血CIK 細胞CD107a 表達高于來自肺癌患者外周血的CIK 細胞(圖4)。2.6 檢測CIK 細胞分泌的細胞因子ELISA 法檢測CIK 細胞分泌的IFN-γ 和TNF-α,臍血CIK 和肺癌患者CIK 分泌IFN-γ 分別為(185.25±30.45)pg/mL 和(148.72±35.83)pg/mL,兩者比較差異有統計學意義(P=0.0352);TNF-α 分別為(20.85±4.58) pg/mL 和(14.88±3.32)pg/mL,兩者比較差異有統計學意義(P=0.0389)。
  2.7 流式檢測腫瘤細胞凋亡實驗結果
  本研究用Annexin V/PI 雙染色檢測來自肺癌患者外周血來源的CIK 細胞和臍血CIK 細胞對K562細胞凋亡的影響。臍血CIK 細胞誘導的K562 細胞凋亡的百分率[Annexin V+PI-細胞:(25.30±4.87)%]高于肺癌患者的CIK 細胞[Annexin V+PI-細胞:(19.87±5.41)%],但是統計學分析結果顯示二者之間差異無統計學意義(P=0.2658)。
  3 討論
  細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)臨床治療惡性腫瘤的安全性和可行性已被很多基礎和臨床試驗確認。CIK 細胞是異質性的細胞群體,包括CD3+CD56+、CD3+CD56-、CD3-CD56+細胞群,其中CD3+CD56+ 細胞來自CD3+CD56- T 細胞,主要負責非主要組織相容性復合體(MHC)限制性的抗腫瘤活性。體外誘導培養的CIK 細胞是單個核細胞在CD3 單抗和多種細胞因子(包括IFN-γ、IL-2 等)作用下產生的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應細胞的異質細胞群,既具有T 淋巴細胞強大的抗腫瘤活性,又具有NK 細胞的非MHC限制性腫瘤殺傷能力,殺瘤活性高、殺瘤譜廣。目前,對于CIK 細胞大規模制備應用和總體療效的評估已經達成一定的共識。本研究在前人經驗的基礎上,比較了來自臍血和肺癌患者外周血來源的CIK 細胞體外抗腫瘤作用及機制的差異,以期為CIK 細胞的臨床應用提供更多的實驗依據。本研究實驗結果表明,與肺癌患者CIK 細胞相比,臍血來源的CIK 細胞表達CD3+CD56+、CD3+CD8+ 的比例更高,具有明顯增強的抗腫瘤作用和增殖能力,同時伴隨增加分泌IFN-γ、TNF-α。IFN-γ 能夠調節機體的免疫力,抑制病毒復制,抑制腫瘤細胞的增殖;TNF-α 除能夠誘導腫瘤細胞凋亡之外,還能夠促進細胞毒性T 細胞的分化以及其他效應因子,如IL-2、IFN-γ 等的產生。CIK 細胞的抗腫瘤機制主要通過效靶細胞的接觸,CIK 細胞表面的黏附分子,白細胞功能相關抗原-1(leukocyte function-associated antigen-1,LFA-1)與腫瘤細胞表達的LFA-1 配體結合, 導致對腫瘤細胞的細胞毒作用;CIK 細胞活化的信號通路主要涉及NK細胞受體與腫瘤細胞表達的配體的結合和被活化,最終導致對腫瘤細胞的脫顆粒和細胞毒性;此外,CIK 細胞由Fas 配體通過Fas 信號通路誘導腫瘤細胞凋亡。效-靶細胞接觸后,微管的極化運動會將溶解性顆粒運輸到細胞之間的免疫突觸中。顆粒一旦到達效應細胞的質膜,質膜就會溶解,顆粒即被釋放到免疫突觸中,最終導致靶細胞死亡。CD107a(LAMP-1)、CD107b(LAMP-2)是溶酶體相關膜糖蛋白(LAMPs)。效應細胞的脫顆粒作用導致細胞內的細胞毒性顆粒膜上存在的CD107a 和b 暴露在細胞表面,這一過程與細胞內穿孔素的流失相關,也與細胞內IFN-γ 的產生相關。因此檢測CD107a 和CD107b 的表達可以更全面的分析CIK 細胞的功能。本研究的結果證實了臍血CIK 細胞CD107a 的表達高于來自肺癌患者外周血的CIK 細胞。
  目前流式檢測技術已廣泛應用于基礎實驗和臨床研究,使用流式細胞儀可以檢測單個細胞水平的增殖, 敏感性大大提高,而且結合單抗標記可以反映不同的細胞亞群的增殖、功能和作用機制,提供的信息更為豐富,同時也大大提高工作效率。本研究的技術路線就是采用流式細胞術同時檢測臍血CIK 和肺癌患者來源的CIK 細胞表型、功能和腫瘤細胞的凋亡等,使實驗結果的準確性和一致性明顯提高。如CIK 細胞的體外抗腫瘤實驗采用流式檢測和MTT 法同步進行,流式細胞術所獲得的檢測結果與MTT 法相比敏感性和重復性更佳。
  綜上所述,本研究為臨床應用CIK 治療提供更多選擇和實驗室依據。后續的研究需要進一步比較不同來源的CIK 細胞在作用機制上的差異,最終為提高臨床療效提供證據。
 

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