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細胞毒性評價應用錦集

2017/10/8 16:16:27??????點擊:

細胞毒性是化學物質(藥物)作用于細胞基本結構及生理過程中,如細胞膜或細胞骨架結構、細胞新陳代謝、細胞組分或產物合成、降解或釋放、離子調控及細胞分裂等過程改變,導致細胞存活、增殖及功能紊亂,所引發的不良反應等。利用多模式功能酶標儀檢測系統,使用光吸收(比色法)、熒光、化學發光及時間分辨熒光等多種檢測方法,可以對不同類型及機理引起的細胞毒性,進行多參數、全方位的檢測及評價。


一、光吸收方法(比色法)

MTT類檢測法:正常細胞代謝旺盛,其線粒體內的琥珀酸脫氫酶可將四唑鹽類物質(如 MTT、XTT、WST-1等)還原為紫色甲臜結晶(Formazan),經DMSO溶解后,在酶標儀上讀取490 nm波長的OD值,OD值大小和活細胞數量線性相關。

CCK8WST-8)檢測法:CCK8檢測方法同MTT類檢測原理類似,利用線粒體內琥珀酸脫氫酶生成可溶于水的橙黃色甲臜物(不需要進一步裂解/溶解),即可直接在酶標儀上讀取450 nm波長的OD值,OD值大小和活細胞數量線性相關。


LDH(乳酸脫氫酶)檢測法LDH(乳酸脫氫酶)是一種穩定的蛋白質,存在于正常細胞的胞質中,一旦細胞膜受損,LDH即被釋放到細胞外。LDH催化乳酸形成**酸鹽,和INT(四唑鹽類)反應形成紫色的結晶物質,在酶標儀上讀取500 nm波長的OD值,通過檢測細胞培養上清中LDH的活性,可判斷細胞膜受損引起的細胞毒性。

SRB檢測法:磺酰羅丹明Sulforhodamine B,SRB)是一種粉紅色陰離子染料,易溶于水,在酸性條件下可特異性地與細胞內組成蛋白質堿性氨基酸結合,在540 nm波長下產生吸收峰,吸光值與細胞量成線性正相關,故可用作細胞存活數的定量檢測。

二、熒光強度方法

阿爾瑪藍(Alamar Blue )檢測法:也稱刃天青(Resazurin),是一種安全無毒的藍色染料。加入培養液中,可作為氧分子電子傳遞鏈的受體,呈現由藍向紅轉變的顏色變化,反映所研究的細胞或微生物對氧分子的消耗,因而常被用作氧化還原指示劑,以顯示被觀察細胞和細菌的代謝活動。阿爾瑪藍的顏色改變可用光吸收測定(570nm測定吸光度,參考波長600nm)。阿爾瑪藍的粉紅色細胞代謝產物,也可用熒光檢測,其激發光波長在530-560 nm之間,發射光波長為590 nm。

線粒體膜電位JC-1檢測法: 線粒體膜電位的下降是細胞毒性評價中細胞凋亡早期的一個標志性事件。 JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential△Ψm的理想熒光探針??梢詸z測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體的基質(matrix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以產生紅色熒光(EX 585 nm/ EM 590 nm);在線粒體膜電位較低時,JC-1不能聚集在線粒體的基質中,此時JC-1為單體(monomer),可以產生綠色熒光(EX 514 nm/ EM 529 nm)。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。因此通過紅綠熒光的相對比例,來衡量由于線粒體去極化引起的細胞早期凋亡。


三、化學發光方法

ATP檢測法ATPLiteATP(三磷酸腺苷)是細胞活性的標志物,因為其僅存在于具有代謝活性的細胞內。因為當細胞經歷壞死或凋亡時,ATP濃度會迅速下降,所以ATP是監測細胞毒性、殺傷、抑制和增殖的一種很好的指示劑。ATPLite方法檢測的是熒光素酶和其底物D-luciferin反應所產生的光信號,在反應過程中需要消耗ATP,其產生的化學發光信號同ATP含量成正比。ATPLite檢測方法靈敏度更高(最低5個細胞/孔),線性范圍可達5個數量級,操作步驟簡單,且信號更加穩定。


四、時間分辨熒光

時間分辨熒光(Time Resolved Fluorescence, TRF)是一種使用鑭系元素(常用Eu)標記的非放射性檢測方法。根據鑭系元素螯合物的發光特點,用時間分辨技術測量其熒光,同時對發射波長和時間兩個參數進行信號分辨,可有效地排除非特異背景熒光的干擾,極大地提高了檢測的靈敏度,是所有非放射性、非均相檢測方法中靈敏度最高的檢測方法。目前該技術已廣泛用于臨床診斷,如新生兒篩查等,與傳統高靈敏度的同位素檢測方法相比,具有相當的靈敏度。

DNA片段化檢測(DELFIA DNA fragmentation):該方法與TUNEL法類似,利用細胞中TdT酶的作用,對凋亡細胞中的片斷化DNA3′-OH游離末端進行高效特異性標記Bio-dUTP(生物素偶聯-UTP),隨后加入Streptavidin –Eu(鑭系元素標記的鏈霉親和素)識別被標記的Bio-dUTP,最后加入Eu解離增強液,通過時間分辨熒光方法檢測Eu鑭系元素的發射信號來評價凋亡細胞中DNA片段化引起的細胞毒性。


DNA復制檢測(DELFIA BrdU ProliferationBrdU是胸腺嘧啶的衍生物,常用于標記活細胞中新合成的DNA,可代替胸腺嘧啶選擇性整合到復制細胞中新合成的DNA中(細胞周期S期)。這種摻入可以穩定存在,隨著DNA復制進入子細胞中。使用Eu標記的BrdU 特異性抗體可以用于檢測BrdU的摻入,從而判斷細胞的增殖能力。Eu標記的BrdU 特異性抗體檢測法與傳統的同位素(3H-Thymidine標記摻入法相比,在檢測靈敏度、信噪比、時間相關性及數據穩定上具有相同的優勢,且安全性更高。



細胞膜通透性檢測(DELFIA BATDA Cytotoxicity):與放射性同位素標記的51Cr釋放試驗測定細胞活性原理類似,在靶細胞中加入BATDA,BATDA能溫和穿透細胞膜,對細胞無毒副作用,BATDA進入細胞后,被細胞內酯酶快速水解為親水性的TDA,TDA不能在穿透細胞膜而滯留在細胞質內。當靶細胞被效應細胞(如NK細胞)識別或受到其他外界條件刺激后,造成細胞膜破損或細胞裂解,TDA就會釋放到溶液中,被Eu標記物識別,最終通過檢測Eu時間分辨熒光的信號,來評價細胞膜的完整性和通透性。該方法與傳統放射性同位素標記的51Cr釋放試驗相比,檢測靈敏度更高,操作時間更短,且靈活、安全。



(來源: 珀金埃爾默生命科學


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