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小分子半抗原抗體制備方法簡述

2017/10/14 10:13:56??????點擊:

大多數藥物、毒素、環境污染物分子質量小于1000u(≈Da),屬于僅有反應原性而無免疫原性的半抗原。目前制備小分子半抗原抗體的常規方法為:選擇具有毒理學意義的代謝產物或原形藥物作為待測物,設計合成保留待測物分子結構特征并帶有活性基團的半抗原,通過共價鍵使半抗原與大分子質量蛋白質載體偶聯,制備人工免疫原,經動物免疫程序制備針對半抗原的特異性抗體。其具體流程及各階段簡述如下。


hapten-antibodies


1、半抗原的設計及基本原則

半抗原設計的目的是使半抗原刺激機體產生特異性免疫應答,并獲得對待測物分子具有高親和力的抗體。

半抗原設計的基本原則如下:

1)免疫原中的半抗原應在分子結構、立體化學和電子分布上與待測物分子盡可能相似;

2)半抗原結構中的連接臂應不易于誘導產生“臂抗體”,最好使用一定長度的碳鏈;

3)半抗原分子應具有便于與蛋白載體偶聯的活性基團(如-NH2、-COOH、-OH、-SH等),且活性基團的存在對待測物分子的電子分布應沒有影響;

4)半抗原與蛋白偶聯后仍應保留待測物分子的基本結構。


2、連接臂的引入

為突出待測物分子的特征結構,半抗原設計時常在特征結構和載體蛋白之間引入一定長度的連接分子,即連接臂。引入連接臂是半抗原抗體制備時較為常用的方案。

有研究報道,在制備小分子半抗原抗體時發現,當使用較短的連接臂或不使用連接臂時不能誘導產生針對半抗原的抗體,而具有較長連接臂的半抗原卻能誘導產生針對半抗原的抗體。

人們對這種現象的解釋是:當連接臂較短或沒有連接臂時,半抗原有可能被載體蛋白的三維結構掩蓋,而當連接臂足夠長時,有利于小分子半抗原充分暴露與載體蛋白的表面,便于抗原遞呈細胞對其的識別。通常認為連接臂的最適長度在3-6個直鏈碳原子之間,連接臂太短不利于半抗原的充分暴露,而連接臂太長又會因為疏水作用而造成烷基鏈的折疊,導致半抗原分子仍然被載體蛋白所掩蓋,不利于抗原遞呈細胞的識別。

此外有研究認為,使用不同結構的連接臂、采用不同的偶聯方法或改變連接臂的引入位置,也有利于抗體的產生,提高抗體的親和力和結合力。


3、活性基團的引入

活性基團的引入有兩種方式:一是利用待測物上已有的活性基團(-NH2、-COOH、-OH、-SH等),通過雙功能試劑(如NH2(CH2)nCOOH、SH(CH2)nCOOH、琥珀酸酐、戊二醛等)引入連接臂和活性基團,使之與載體蛋白偶聯。這種方法的優點是比較容易實施,但對于一些待測物,若這些活性基團是其特征結構,或偶聯后改變了分子的電子分布,則會影響抗體對待測物的識別。

另一種方法是直接合成待測物的帶有-(CH2)nCOOH、-(CH2)nNH2等結構的衍生物,這種方法有利于保護待測物的特征結構和分子的電子分布不受影響,但合成上有時比較困難,往往需要多步反應才能實現。


4、異質半抗原的使用

使用異質半抗原是一種間接提高抗體對待測物親和力的方法。近年來,有研究者提出了利用“位阻效應”的半抗原設計理念,發現在人工免疫原的半抗原中合理引入不同程度的空間位阻,所誘導產生的多克隆抗體可以對一系列同系物中不同大小的分子進行選擇性識別。

此外,有研究表明,在競爭性的免疫學檢測方法中,包被原或酶標記物使用位阻較大的半抗原結構,可降低其對抗體的結合能力,從而相對地提高了游離待測物和抗體的親和力,可以使靈敏度和特異性均得到較大的提高。


5、半抗原載體蛋白的選擇

由于大多數藥物、毒素、環境污染物等半抗原物質無免疫源性,通常需與大分子質量載體蛋白偶聯制備完全抗原(免疫原),借助載體蛋白的T細胞表位獲得免疫源性,以便刺激機體產生抗體。制備完全抗原時常用的載體有牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、兔血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)、多聚賴氨酸(PLL)等。此外,為了獲得更好的免疫效果,常使用免疫佐劑。

近年來,許多新型的載體和佐劑被應用于抗體的制備,其中一種由脂蛋白和Th細胞表面抗原決定簇的共價連接物(P3CS-Th)構成的低分子質量載體佐劑系統在小分子抗體的制備中表現出較好的效果和廣闊的應用前景。

半抗原通過與載體蛋白結合形成復合物,往往可以是半抗原獲得免疫源性而產生較好的抗體。但是對于分子量較小的半抗原,尤其是分子量小于300u的半抗原,有時難以獲得針對藥物小分子的高親和力抗體。Chappey等對分子質量為111-1202u的半抗原誘導產生抗體的親和系數做過研究,結果表明,分子質量為334-374u的半抗原誘導產生的抗體仍具有較高的親和系數,但對于分子質量低于300u的半抗原,獲得高親和力抗體的可能性將顯著下降,從而導致以競爭性酶聯免疫吸附測定為代表的競爭性免疫分析方法檢測靈敏度的下降。然而,近年發展起來的基因工程抗體有望解決這一難題。


6、基因工程抗體

噬菌體抗體庫技術是利用基因工程技術發展起來的一種模擬自然免疫選擇系統制備抗體的新技術,與多克隆抗體和單克隆抗體相比,噬菌體抗體庫技術的篩選范圍廣、時間周期短、操作方便、規模生產成本低廉。其基本原理是,獲取抗體可變區重鏈和輕鏈基因,通過一段接頭DNA拼接后,再與噬菌體頭部蛋白G3P等基因5端重組,通過噬菌體表面展示技術把單鏈抗體表達在噬菌體表面,經抗原固定化篩選,實現了基因表達盒表達產物的親和選擇。

由于基因工程抗體在篩選方式及產量上所具有的明顯優勢,所以許多研究者認為基因工程抗體可以稱為新的小分子半抗原抗體的來源。

此外,基因操作使人們可以通過融合蛋白基因表達的方式獲得包括若干功能域和報告域的融合蛋白,通過這種方式可以制備同時具有免疫學特性功能域和酶催化特性報告域(如堿性磷酸酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白等)的融合蛋白,并利用其功能域對半抗原的親和性和報告域的酶促級聯放大作用進行免疫學檢測,較之傳統使用酶聯第二抗體的方法節約了檢測時間和檢測成本。


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