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BCA蛋白定量試劑盒

2017/3/11 22:19:00

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詳細介紹



BCA蛋白定量試劑盒

Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination


貨號 組份A
組份B
BSA標準品
規格
價格
PD-BCA-125
125 ml
3 ml  1X 1 ml
可供62個試管,或696孔板測試用
348元
PD-BCA-500
500 ml
12 ml
2 X 1 ml
可供250個試管,或2596孔板測試用
798
BSA標準品為5 mg/ml BSA,溶于水中,含0.05%疊氮鈉。



室溫運輸和儲存。如出現沉淀可稍加熱并攪拌使其溶解。BSA標準品保存在-20度,如出現微生物污染則應丟棄。


BCA蛋白定量試劑盒檢測范圍是5-2000 μg/ml,如需檢測更低濃度的蛋白,可使用增強型BCA蛋白定量試劑盒。增強型BCA蛋白定量試劑盒采用了濃縮型試劑配方,提高了孵育時間和溫度,因此可以增加樣品體積和增加光吸收值,從而能夠檢測更低濃度的蛋白,檢測范圍可低至0.520 μg/ml,具體可參考:  http://www.hcgdietersource.com/Product/3650481235.html



一、產品簡介

BCA蛋白定量試劑盒(常簡稱為BCA試劑盒)是一種基于二喹啉甲酸比色法的總蛋白檢測和定量試劑盒,比Lowry法更為優越。BCA蛋白定量法以快速靈敏、穩定可靠且對不同種類蛋白質變異系數甚小而深受專業人士的青睞,樣品中離子型和非離子型去污劑對其影響較小,檢測不同蛋白質分子的變異系數遠小于考馬斯亮藍。BCA法測蛋白濃度的原理:在堿性環境下,蛋白質將銅離子還原成亞銅離子,二喹啉甲酸(BCA)與亞銅離子形成紫色的絡合物,這種絡合物溶于水并在562 nm處產生光吸收峰值,光吸收強度在一定范圍內與蛋白質含量呈近似線性關系,因此使用比色法可以對蛋白質進行檢測和定量。BCA法沒有反應終點,反應會隨著時間而持續進行;通過一段時間的孵育后,反應速度會變慢,從而可以對大量樣品進行檢測。

在蛋白質的大分子結構中,與BCA反應顏色形成相關的是肽鍵和四種氨基酸(半胱氨酸,胱氨酸,色氨酸,以及酪氨酸)。對二肽、三肽和四肽的研究表明,反應顏色的形成不僅僅是單個的功能基團效果疊加的結果。因此,蛋白濃度通常是根據標準對照蛋白(常用牛血清白蛋白BSA)推測而來的,即:將標準對照蛋白的光吸收值做一個濃度梯度標準曲線,未知樣品的光吸收值參照曲線方程計算出蛋白濃度值。


二、標準蛋白和工作液的配制

A.       配制牛血清白蛋白梯度:可參考下表來配制BSA濃度梯度,最好使用與待測樣品相同的溶劑??砂幢壤糯蠡蚩s小,根據實際需要計算所需用量。

 




B.       BCA工作液的配制

1.        根據需要測定的未知樣品和蛋白標準品的數量以及復孔數來計算所需的BCA工作液體積。如使用試管進行測試,每管需2.0 mL工作液, 而使用96孔板進行測試則每孔需200 μl 工作液。

2.        按 組份A:組份B=50:1 的比例配制BCA工作液。組份B加入組份A的時候,開始會出現渾濁并隨著混勻很快消失,最終混勻后溶液呈蘋果綠色。配置好的工作液在室溫密閉的條件下24小時內穩定。


三、操作步驟

1.        如在試管中進行反應,取100 μLBSA蛋白梯度或者待測樣品,放入標記好的試管中,再每管加入2.0mL 工作液,充分混勻, 蓋上蓋子,并在選定的溫度條件下孵育:

·          室溫:                                      室溫孵育 2 hours (檢測范圍: 20-2000 μg/ml)

·          37度:                                     37°C 孵育30 minutes (檢測范圍: 20-2000 μg/ml)

·          60度:                                   60°C 孵育30 minutes (檢測范圍: 5-250 μg/ml)

延長孵育時間會增加光吸收值;應使用水浴法加熱,以使得溫度均衡上升;用鼓風法升溫會導致溫度不均衡,使實驗誤差增大。

2.        如需在96孔板中進行反應,則每孔放入10 μlBSA蛋白梯度或者待測樣品,再加入200 μl工作液,充分混勻,37度孵育30分鐘,檢測范圍為125-2000 μg/ml;也可以將BSA蛋白梯度和待測樣品提高到每孔25 μl,再加入200 μl工作液,充分混勻,37度孵育30分鐘,此時檢測范圍為20-2000 μg/ml,但是可能會較多受到樣品中的干擾物質的干擾;應使用水浴法加熱。

3.        將試管或96孔板冷卻至室溫。

4.        用分光光度計或酶標儀在562 nm處讀取光吸收值所有樣品應在10分鐘內讀完。因為BCA反應沒有終點,隨著時間的推移光吸收值會繼續上升,在10分鐘內讀完所有樣品可以避免產生明顯的誤差。

5.        將BSA蛋白標準品和待測樣品的光吸收值減去空白對照值,以得到的蛋白標準品光吸收值對蛋白濃度作標準曲線,根據這個曲線方程計算待測樣品的蛋白濃度。


四、注意事項:

·          測定蛋白濃度時,最好使未知樣品的蛋白濃度處于標準擬合曲線的接近中間位置,這樣獲得的結果更準確。

·          通過增加孵育時間或者提高樣品比例,可以提高光吸收值,從而可以檢測更低的蛋白量,但是會縮小檢測范圍,可根據實際需要進行調整,同時注意不要超過儀器的檢測上限。

·          酶標儀的檢測光徑比分光光度計的比色杯短,因而檢測靈敏度有所降低。

·          最適檢測波長為562 nm。在540 nm到590 nm區間也可進行檢測, 但標準曲線斜率和檢測靈敏度都會有所降低。

·          對酶標儀的讀數進行曲線擬合時, 采用four-parameter (quadratic)  best-fit curve 進行擬合可以獲得比線性擬合更準確的結果;手工擬合時可采用線性擬合法。

·          EDTA濃度必須小于10 mM,不兼容EGTA。不適用BCA法時,請使用Bradford蛋白濃度測定法。

·          每種常用的總蛋白測定方法測定不同的蛋白時都有一些偏差。導致產生這些偏差的原因有:蛋白質的氨基酸序列,等電點,蛋白的結構,特定種類的氨基酸側鏈和輔基。有些種類的氨基酸側鏈和輔基能對顯色反應產生很大的影響。大部分蛋白測定方法都使用牛血清白蛋白(BSA)或免疫球蛋白(IgG)作為標準品來制作標準曲線。如果需要特別精確的檢測結果,可以使用待測蛋白的純品來制作標準曲線。

·          一些物質可以干擾BCA反應,如還原劑、絡合劑,以及強酸和強堿。還有一些物質干擾較小,只要不超過最大兼容濃度即不影響反應的進行。詳見BCA反應兼容物列表》。

·          本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品。

·          為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。


五、常見問題

 

問題

可能原因

解決辦法

沒有顏色

樣品中含有銅離子絡合劑

1,透析,脫鹽,或稀釋樣品;

2,提高工作液中銅離子的濃度,如提高A:B50:2;

3,使用蛋白沉淀法去除干擾物

空白對照孔光吸收值正常,

但是蛋白標準品和待測樣品

光吸收值低于預期

樣品所用溶劑是強酸堿性緩

沖液,改變了工作液的pH

透析,脫鹽,或稀釋樣品

光吸收波長選擇錯誤

562 nm讀取光吸收值。

待測樣品孔光吸收值高于預期

蛋白濃度過高

稀釋樣品

樣品中含有脂類或脂蛋白

向樣品中加入2% SDS以除去脂類

干擾

使用蛋白沉淀法去除干擾物

所有孔,包括空白對照孔,呈暗紫色

緩沖液中含有還原劑

1,透析或稀釋樣品;

2,使用蛋白沉淀法去除干擾物

緩沖液中含有硫醇

緩沖液中含有生物胺(兒茶酚胺)

需要用不同的波長讀取光吸收值

酶標儀或分光光度計沒有562nm濾光片

可以讀取540 nm590 nm區間的光吸收值, 但是標準曲線的斜率和檢測靈敏度都會降低。

 

六、BCA反應干擾物

A.       BCA反應的干擾物

一些物質可以干擾BCA反應,如還原劑、絡合劑,以及強酸和強堿。樣品中應避免含有這些物質:維生素C ,EGTA,鐵,不純的蔗糖,兒茶酚胺,不純的甘油,脂類,色氨酸,肌酸酐,過氧化氫,蜜二糖,酪氨酸,半胱氨酸,酰肼類,酚紅,尿酸。

還有一些物質對BCA反應干擾程度比較低,在一定濃度以下不會產生影響。下表列出了一些物質的最大兼容濃度。在列出的濃度下這些物質對試管法進行的BCA反應造成的誤差不大于10%。提高樣品與BCA工作液的比例會使得最大兼容濃度降低。不同物質對BCA反應的干擾可能會有疊加效應。

B.       如何去除干擾物或者將其干擾最小化

可以使用以下方法中的一種去除干擾物或者降低干擾:

·          通過透析或凝膠過濾去除干擾物。

·          將樣品稀釋,直至BCA反應不再受到干擾。這個方法需要注意的是,稀釋后的蛋白濃度須處于可檢測范圍內。

·          可參考本文的方法,用**或三氯醋酸沉淀樣品中的蛋白,去除含干擾物的上清后,將蛋白沉淀用水重新溶解,或者直接加入BCA工作液進行檢測和定量。

·          提高工作液中銅離子的濃度,一些情況下可以消除銅離子絡合劑的干擾。

注意:蛋白標準品應采用與待測樣品同樣的處理方式,這樣可以使檢測結果更準確。

 

C.       沉淀蛋白的方法(僅供參考)

參考方法一:TCA沉淀法

1、取500 ul蛋白溶液,加入等體積預冷的20%TCA溶液,立刻混勻。

2、冰上放置30分鐘。 

3、4 ℃,13200 r/min離心15分鐘。 

4、小心去除上清液,冷凍干燥沉淀,約1小時。

5、加入5 ul PBS溶解沉淀。 

 

三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白質主要基于以下幾個方面的作用:在酸性條件下TCA能與蛋白質形成不溶性鹽;TCA作為蛋白質變性劑使蛋白質構象發生改變,暴露出較多的疏水性基團,使之聚集沉淀。  

 

 

參考方法二:**沉淀法 

1、在-20 ℃預冷**溶液。 

2、500 ul蛋白液放置于5 ml管中,加入3 ml預冷**,迅速混勻,-20 ℃放置2小時以上或過夜。 

3、4 ℃,13200 r/min離心15分鐘。 

4、小心棄去上清液,注意勿接觸沉淀。加入100 ml冷的90%**洗滌沉淀,4 ℃,13200 r/min離心5分鐘。

5、重復上一步再次洗滌沉淀。 

6、棄去上清液,空氣中干燥沉淀15-30分鐘。

7、加入適量PBS溶解蛋白質沉淀。

 

**沉淀蛋白質時,必須在0-4 ℃低溫下進行。蛋白質被**沉淀后,應立即分離,否則蛋白質會變性。

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